Potential immunological markers for diagnosis and therapeutic assessment of toxocariasis / Estudo de marcadores imunológicos para o diagnóstico e avaliação terapêutica da toxocaríase

In human toxocariasis, there are few approaches using immunological markers for diagnosis and therapeutic assessment. An immunoblot (IB) assay using excretory-secretory Toxocara canis antigen was standardized for monitoring IgG, IgE and IgA antibodies in 27 children with toxocariasis (23 visceral, three mixed visceral and ocular, and one ocular form) for 22-116 months after chemotherapy. IB sensitivity was 100 percent for IgG antibodies to bands of molecular weight 29-38, 48-54, 95-116, 121-162, >205 kDa, 80.8 percent for IgE to 29-38, 48-54, 95-121, > 205 kDa, and 65.4 percent for IgA to 29-38, 48-54, 81-93 kDa. Candidates for diagnostic markers should be IgG antibodies to bands of low molecular weight (29-38 and 48-54 kDa). One group of patients presented the same antibody reactivity to all bands throughout the follow-up study; in the other group, antibodies decayed partially or completely to some or all bands, but these changes were not correlated with time after chemotherapy. Candidates for monitoring patients after chemotherapy may be IgG antibodies to > 205 kDa fractions, IgA to 29-38, 48-54, 81-93 kDa and IgE to 95-121 kDa. Further identification of antigen epitopes related to these markers will allow the development of sensitive and specific immunoassays for the diagnosis and therapeutic assessment of toxocariasis.

Métodos imunológicos desempenham papel importante no diagnóstico da toxocaríase, entretanto há poucos estudos sobre marcadores diagnósticos e de acompanhamento terapêutico. Foi padronizado ensaio de immunoblot (IB) empregando antígeno de excreção-secreção de Toxocara canis para pesquisa de anticorpos IgG, IgE e IgA em 27 crianças com toxocaríase nas formas visceral (23), mista visceral e ocular (3) e ocular (1), por 22-116 meses após quimioterapia. Foram observados dois perfis de reatividade dos anticorpos: permanência contra todas as frações no decorrer do estudo; diminuição ou negativação contra algumas ou todas as frações, porém, essas mudanças não se correlacionaram com tempo de tratamento. A sensibilidade do IB foi 100,0 por cento para anticorpos IgG específicos para frações de massa molecular de 29-38, 48-54, 95-116, 121-162, > 205 kDa, 80,8 por cento para IgE específicos para 29-38, 48-54, 95-121, > 205 kDa e 65,4 por cento para IgA específicos para 29-38, 48-54, 81-93 kDa. Anticorpos IgG específicos para frações de baixa MM (29-38 e 48-54 kDa) podem ser sugeridos como candidatos a marcadores diagnósticos. Por sua vez, anticorpos IgG para fração > 205 kDa, IgA para 29-38, 48-54, 81-93 kDa e IgE para 95-121 kDa podem ser candidatos a marcadores terapêuticos. A identificação de epítopos antigênicos relacionados a estes marcadores poderá ser importante para o desenvolvimento de ensaios altamente sensíveis e específicos no diagnóstico e avaliação terapêutica da toxocaríase.

Serodiagnosis of neurocysticercosis in patients with epileptic seizure using ELISA and immunoblot assay

Sera from 88 patients from Santa Catarina and São Paulo states of Brazil, with epileptic seizures who underwent cerebral computed tomography (CT) were analyzed for the detection of antibodies to T. solium cysticercus by ELISA and Immunoblot (IB) with the following antigens: Taenia solium cysticercus total saline (Tso), Taenia crassiceps cysticercus vesicular fluid (Tcra-vf) and T. crassiceps cysticercus glycoproteins (Tcra-gp). ELISA carried out with Tso, Tcra-vf and Tcra-gp antigens showed 95 percent, 90 percent and 80 percent sensitivities, respectively, and 68 percent, 85 percent and 93 percent specificities, respectively. In the epileptic patients group, ELISA positivity was 30 percent, 51 percent and 35 percent with Tso, Tcra-vf and Tcra-gp antigens respectively. Considering the IB as the confirmatory test, the positivity was 16 percent (14/88) in the epileptic patients total group and 22 percent (12/54) in the epileptic patients with positive CT and signals of cysticercosis. We found a significant statistical correlation among ELISA or IB results and the phase of the disease when any antigens were used (p < 0.05). We emphasize the need to introduce in the laboratory routine the search for neurocysticercosis (NC) in patients presenting with epileptic seizures because of the high risk of acquiring NC in our region and its potential cause of epilepsy.

Amostras de soro de 88 pacientes dos Estados de Santa Catarina e São Paulo, Brasil, com crises epilépticas e que se submeteram a exame de Tomografia Computadorizada (TC), foram examinadas para detecção de anticorpos anti-cisticercos de Taenia solium por meio de ELISA e Immunoblot (IB) utilizando-se os seguintes antígenos: extrato salino total de cisticercos de T. solium (Tso); líquido vesicular de Taenia crassiceps (Tcra-vf) e glicoproteínas purificadas de cisticercos de T. crassiceps (Tcra-gp). Os resultados de ELISA com os antígenos Tso, Tcra-vf e Tcra-gp mostraram 95 por cento, 90 por cento e 80 por cento de sensibilidade, respectivamente, e 68 por cento, 85 por cento e 93 por cento de especificidade, respectivamente. No grupo de pacientes epilépticos, a positividade do ELISA foi 30 por cento, 51 por cento e 35 por cento com os antígenos Tso, Tcra-vf e Tcra-gp, respectivamente. Considerando o IB como teste confirmatório, a positividade foi de 16 por cento (14/88) no grupo total de pacientes epilépticos e 22 por cento (12/54) no grupo de pacientes epilépticos com TC positiva e sinais clínicos compatíveis com neurocisticercose. Foi encontrada correlação estatística significativa entre os resultados de ELISA ou IB e a fase da doença com quaisquer dos antígenos utilizados (p < 0,05). Os resultados indicam a necessidade de introduzir na rotina dos laboratórios o diagnóstico de neurocisticercose nos pacientes com convulsões epilépticas devido ao elevado risco de aquisição da cisticercose em nossa região e sua participação na etiologia da epilepsia.

Effect of cell culture system on the production of human viral antigens

Foi realizado estudo comparativo na produção de diferentes antígenos virais usando sistema de microcarregador e sistema tradicional. Células Vero, BHK e MA-104 foram cultivadas em microcarregadores (2mg/ml) utilizando-se biorreatores com capacidade de 3,7 litros e, em paralelo, no sistema convencional com garrafas Roux. Após quatro dias de cultura para as células BHK e sete dias para as células Vero e MA-104, as células foram infectadas com 0,1 MOI (multiplicidade de infecção) de vírus da raiva, vírus do sarampo, poliovírus e rotavírus. Foi determinado o rendimento das células e dos vírus em microcarregadores e sistema convencional. Foi observado no sistema de microcarregador um aumento médio obtido de vinte vezes mais células/ml em relação à cultura convencional em monocamadas, usando garrafas Roux. Por outro lado, as células que cresceram em garrafas Roux apresentaram 1,6 a 6,7 mais vírus/ml em culturas do que no sistema de microcarregador. Contudo o total das amostras em termos de vírus por grupo foi estatisticamente similar para ambos os sistemas (p > 0,05). O rendimento na produção de antígeno viral pode depender não somente da concentração das células, mas também de outros fatores da cultura, como características do suporte no crescimento. Assim, o estudo deste parâmetro pode proporcionar uma linha de base para um futuro melhoramento e estratégias para se estabelecer um aumento em escala na produção de vírus, já que, dependendo do tipo de vírus, a ótima condição encontrada para uma produção de vírus em pequena escala pode não ser adequada para a produção em grande escala, requerendo novas padronização e avaliação.

New prevalence estimate of TT virus (TTV) infection in low- and high-risk population from Säo Paulo, Brazil

The prevalence of TT virus (TTV) infection was investigated by Polymerase Chain Reaction (PCR) in low- (blood donors and healthy children/adolescents) and high-risk (hemophiliacs) groups from Säo Paulo, Brazil. Primers based on the untranslated region (UTR) of the viral genome proved to be much more ubiquitous, leading to much higher frequencies for both groups ( > or = 81 percent) than the earlier N22-PCR directed to the open reading frame 1 (blood donors, 5.5 percent, and hemophiliacs, 42.3 percent). The UTR-PCR also revealed an interesting profile for healthy children/adolescents: very high prevalence at the early years and significant decrease in male teenagers. The N22-PCR, in turn, demonstrated higher frequency in hemophiliacs treated with fresh blood products (58 percent), than in those treated with virus-inactivated clotting factors (9.4 percent) and blood donors (5.5 percent)

Measles serodiagnosis: production and evaluation of the IgM-measles ELISA(IAL) reagent

Recent measles outbreaks in different countries led to an increase of laboratory measles diagnosis. Thus, we developed the IgM-Measles ELISAIAL, using measles virus antigens obtained from cell cultured in microcarriers in order to supply reagent kits to Brazilian public health laboratories. A batch of antigenic reagent was produced and evaluated in the enzyme immunoassay in comparison with clinical diagnosis and with as reference assay (IgM Capture ELISA(CDC)) data. This study was performed in a positive panel with 70 serum samples from patients with measles, and a negative panel with 132 samples from patients with unrelated diseases and without recent measles or vaccination history. In relation to other diagnostic methods, the IgM ELISAIAL presented sensitivity higher than 97.1 per cente, specificity and precision of 97 per cente, and agreement kappa (k) index higher than 0.94 (P < 0.05). Moreover, the IgM antibody profile from measles acute phase revealed by the assay was similar to the reference assay. A practical analysis system for checking the quality of new reagent batches was proposed based on the diagnostic features and agreement kappa index. Our findings suggest that measles antigenic reagents can be produced with reliable quality control system, and supplied to public health laboratories for routine serodiagnosis or population surveys.

Urinary tract infection: detection of Escherichia coli antigens in human urine with an ELIEDA immunoenzymatic assay

Escherichia coli is the most common causative agent of urinary tract infection (UTI), and diagnosing this infection usually relies on bacteriologic methods. Nevertheless, screening methods can be useful for a rapid presumptive diagnosis even though some of these screening methods have low sensitivity or are expensive. To investigate a possible new alternativa approach, an antigen-based immunoassay-enzyme-linked immunoelectrodiffusion assay (ELIEDA)- was standardized for screening for this bacterial infection. Combining counter-immunoelectrophoresis with an immunoenzymatic assay, the ELIEDA requires concentrated urine specimens, a cellulose acetate membrane, polyclonal antibodies to E. coli raised in rabbits, and peroxidase-labeled sheep antibodies to rabbit immunoglobulin G (IgG). This ELIEDA technique was evaluated using 244 urine specimens, 76 of them with E.coli, 47 with heterologous bacteria, and 121 without bacteria. In comparison to bacteriologic methods, the sensitivity, specificity, and positive and negative predictive values for the ELIEDA were 93.4 por ciento, 98.2 por ciento, 95.9 por ciento, and 97.1, respectively. The data obtained suggest that this assay is useful for routine diagnostic screening for UTI caused by E.coli. In addition, since the ELIEDA stained membranes can be stored, this assay makes retrospective studies possible

Decay of antibody isotypes against early developmental stages of Schistosoma mansoni after treatment of schistosomiasis patients

Em pacientes com esquistossomose, säo encontrados anticorpos contra grande número de antigenos parasitários, e aqueles contra formas evolutivas jovens do parasita demonstraram que eram eficientes marcadores imunológicos para o diagnóstico da esquistossomose. Padröes de queda de anticorpos IgM e IgG contra cercaria e esquistossomulo foram aqui estudados, comparativamente aos dos anticorpos contra verme e ovo, em pacientes esquistossomoticos após quimioterapia, abordando aspectos soroepidemiologicos. Dados obtidos no estudo de 359 amostras de soros, pertencentes a pacientes infectados por Schistosoma mansoni, individuos näo infectados e pacientes acompanhados pos-tratamento por um periodo de 12 a 15 meses...

Sorodiagnóstico da Doença de Chagas: novo reagente para o teste de hemaglutinaçäo indireta (THAIIAL) / Chagas' disease serological diagnosis: a new reagent to the indirect hemagglutination test (IHATIAL)

A new reagent was designed to the indirect hemagglutination test (IHATIAL), utilizing goose red blood cells as inert matrix and standardized for the field diagnosis of American trypanosomiasis. The objective was to substitute the lyophilized or frozen reagent of IHAT produced routinely using human erythrocytes in the Adolfo Lutz Institute (Säo Paulo/Brazil). The standardized reagent presented a long stability in liquid suspension, and was evaluated in 137 serum samples from patient with and without Chagas' disease, by IHATIAL. The diagnostic performance of this test was similar to the IHAT utilizing human erythrocytes and to that of a commercial IHAT kit. The sensitivity was 1.00, specificity 0.98, predictive value of positive 0.96 and of negative 1.00. Different batches of reagent successively produced proved to be reproducible in a quality control method. The new reagent is more economic than the former reagent, it can be produced easily and may be applicable to the seroepidemiologic studies.

Imunodiagnóstico da esquistossomose mansônica com baixa carga parasitária / Immunodiagnosis of schistosomiasis mansonsi with light worm burden

Presently, the schistosomiasis mansoni with low worm burden is frequent, thus immunologic assays of interest for the field diagnosis of Schistosoma mansoni light infections were evaluated here. Assays not assessed before (group I) and those requiring better validation (group II) for the screening of light infections were included in this study. In the group I, the immunofluorescence assays for the detection of IgM antibodies to worm antigens (IgM IFAw) and IgG antibodies to egg antigens (IgG IFAe) gave high levels of sensitivity, specificity, efficiency and predictive value of positive. However, the immunoenzymatic assays for the detection of IgM antibodies to worm antigens (IgM ELISAw) and to egg antigens (IgM ELISAe) had lower levels than the former assays. The assays from the group II designed mostly for the detection of IgG antibodies to same parasite antigens showed good diagnostic performance. The data obtained here contributed to evidenciate at least three category of immunoassays, and we concluded that those from the category I are suitable for seroepidemiologic purposes by keeping their diagnostic features unchanged even varying significantly the intensity of S. mansoni infection.

Schistosoma mansoni circulating polysaccharide and protein antigens recognized by sheep antisera in patients with different clinical forms of schistosomiasis before and after treatment

Dois antissoros produzidos em carneiros, um dos quais contra a fracao polissacaridica (Po) e outro contra componentes proteicos (Pt) de vermes adultos de Schistosoma mansoni, foram avaliados quanto ao seu desempenho na deteccao de antigenos parasitarios circulantes em pacientes com diferentes formas ciclicas da esquistossomose mansonica, atraves de um ensaio imunoenzimatico, (ELISA). O primeiro antissoro revelava antigenos parasitarios no granuloma hepatico e o segundo, nos glomerulos renais de pacientes com esquistossomose mansonica, bem como em camundongos experimentalmente infectados pelo S. mansoni....

Measles serodiagnosis standardization and evaluation of a Dot-ELISA

A tecnica de Dot-ELISA (DE) para deteccao de anticorpos IgM e IgG anti virus do sarampo foi padronizada e avaliada utilizando-se antigeno viral obtido por tratamento com desoxicolato de sodio (DOC). Foram estudadas 192 amostras de soros, compreendendo 47 amostras de 22 pacientes com sarampo nas fases aguda e convalescente, 55 amostras de soros de criancas antes da vacinacao, tendo 9 meses de idade, 41 amostras de soros de criancas da mesma idade colhidas apos vacinacao e 49 amostras de soros de pacientes com outras patologias....

Alkaline soluble Trypanosoma cruzi epimastigote antigen (ASEA) applied to Dot-ELISA

O antigeno de epimastigota do T. cruzi solubilizado em meio alcalino (ASEA) foi avaliado em dot-ELISA para o diagnostico da doenca de Chagas. Amostras de soros (355) de chagasicos e nao chagasicos foram estudadas e anticorpos IgG contra ASEA foram encontrados em todos os pacientes com a doenca chagasica cronica....

Schistosoma mansoni cercaria and schistosomulum antigens in serodiagnosis of schistosomiasis

Schistosoma mansoni cercaria and schistosomulum obtained in vitro were used in immunofluorescence (IF) tests and indirect hemagglutination (IHA) tests of 137 study sera, 44 from subjects infected with S. mansoni and 93 from healthy subjects residing outside áreas endemic for the disease. The results of these tests were compared with those obtained by testing the same sera using conventional adult worm antigen, and also with the initial clinical and parasitologic diagnoses of the 137 subjects providing the study sera. Regarding sera from acute versus chronic cases, IF testing of the acute sera consistently detected IgA antibodies along with IgM and IgG, the last two being found consistently in chronic sera. Also, the geometric mean of the IgM antibody titers found in the IF tets was higher for acute that for chronic sera. Excluding IF IgA, which was negative for chronic cases, the sensitivity of the other types of tests (IF IgG, IF IgM, and IHA) using cercaria and schistosomulum antigens, both under evaluation, ranged from 0.773 to 0.955, the specificity ranged from 0.957 to 1.000, the efficiency ranged from 0.927 to 0.985, the predective value of positives ranged from 0.909 to 1.000, and the predective value of negatives ranged from 0.903 to 0.979. No statistical differences were observed between these results and those obtained with conventional adult worm antigen. This suggests that cercaria and schistosomulum antigens, both of which can be produced more quickly and cheaply than adult worm antigen, could serve as reliable alternatives to adult worm antigen in the serodiagnosis of schistosomiasis mansoni

The epidemiology and control of schistosomiasis mansoni where Biomphalaria tenagophila is the snail host

Desde 1980, está-se estudando a epidemiologia e o controle da esquistossomose mansônica no Município de Pedro de Toledo (Estado de Säo Paulo, Brasil). Em 1980 a prevalência avaliada por exame de fezes (métodos de Kato-Katz) foi de 22,8%. Estatisticamente, ao nível de 5%, näo houve diferença nas prevalências observadas nas zonas rural e urbana. A intensidade de infecçäo foi baixa (média geométrica de 58,5 ovos por grama de fezes). As maiores prevalências e intensidades de infecçäo foram registradas na faixa etária de 5 a 29 anos. Geralmente a transmissäo da endemia verificou-se durante o lazer. Apenas 0,4% de B. tenagophila mostraram-se positivos para cercárias de S. mansoni. A maioria dos portadores era assintomático. O programa de controle foi intensificado após avaliaçäo dos dados de 1980, resultando em diminuiçäo acentuada da prevalência de 22,8% em 1980 para 6%. Esta prevalência residual vem se mantendo ate 1987. Agora iniciamos estudos para investigar as possíveis causas dessa prevalência residual.

Lectins for the detection of IgM antibodies to T. gondii in the diagnosis of acute toxoplasmosis by immunofluorescence test

Lectinas foram marcadas com fluoresceína e testadas na reaçäo de imunofluoresceína e testadas na reaçäo de imunofluorescência para a detecçäo de anticorpos anti-T. gondii, no diagnóstico da toxoplasmose aguda. Neste estudo tentou-se encontrar reagentes alternativos para conjugados fluorescentes anti-IgM humano (CFAIgMH), que com freqüência contém anticorpos antitoxoplasma, como contaminantes, devido às infecçöes naturais por T. gondii, entre os animais utilizados para imunizaçäo. Conjugados fluorescentes de lectina de lentilha (CFL) (Lens culinaris) forneceram resultados satisfatórios. Avaliaçäo do CFL efetuada em total de 179 amostras de soros de pacientes com toxoplasmose aguda e crônica, com infecçöes näo relacionadas e de indivíduos sadios, mostrou valores altos nos índices de eficiência relativa, co-positividade e co-negatividade, respectivamente de 0,989, 0,969 e 1,000, em relaçäo ao CFFAIgMH convencional. Além disso, três partidas de CFL preparadas sucessivamente forneceram resultados reprodutíveis. A vantagem de se empregar o LFC como reagente alternativo no diagnóstico sorológico da toxoplasmose aguda consiste nos aspectos práticos da sua preparaçäo

Schistosomiasis mansoni: immunodiagnosis aspects and search for an immunological marker related to therapeutic efficacy

The recent findings on immunodiagnosis of schistosomiasis mansoni have shown that purified Schistosoma mansoni antigens do not provide maximum positivity. Therefore, the authors suggest the use of semi-purified antigens for diagnostic purposes. So far, no serological marker for cured patients as shown by negative stool examination was found. However, a tendency of IgG antibody titre decrease was observed, when egg antigen was used.

Diagrama de verificacion para evaluar reactivos de hemaglutinacion usados en el diagnostico de la enfermedad de Chagas / A control chart method for evaluating hemagglutination reagent used in Chagas' disease diagnosis

Se describe la tecnica del diagrama de verificacion, menos complicada y mas apta que la tecnica de analisis secuencial para evaluar lotes pequenos de reactivo. En este método se necesitan un reactivo de referencia, un conjunto de alrededor de 20 muestras de suero y un limite establecido de la varianza que, cuando es sobrepasado, determina el rechazo del lote puesto a prueba. La mitad de las muestras de suero deben ser reactivas con respecto al antigeno de Trypanosoma cruzi y la otra mitad deben ser no reactivas; los sueros reactivos tienen que ser utiles en el sentido que su respuesta ante un reactivo de buena calidad (como el de referencia) es distinta de la que manifiestan ante un mal reactivo. Con este procedimiento, el reactivo de referencia y el reactivo que se quiere evaluar se ponen a prueba con el conjunto de muestras de suero; se observan las diferencias entre los titulos obtenidos con los dos reactivos y se calcula la desviacion estandar promedio. Cuando esta es inferior al limite de verificacion previamente establecido, el lote de reactivo es aceptado; si supera el limite, se rechaza el lote. La experiencia del Laboratorio de Inmunologia del Instituto de Medicina Tropical de Sao Paulo, Brasil, ha demostrado que los sueros que producen titulos relativamente altos pueden usarse para detectar reactivos de mala calidad, y que es eficaz la conservacion de los sueros en un volumen igual de glicerina, almacenados a -20 °C